熒光定量PCR檢測故障導航標

 　　熒光定量PCR檢測的基本原理就是在PCR擴增過程中，隨著PCR循環數的遞增，PCR產物不斷積累，熒光信號也會相應的增加，這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應進行實時的監測。實現基因的相對定量、定量和定性分析。熒光定量PCR檢測系統采用熱電制冷器實現金屬模塊變溫，即通過微機自動控制電路去控制熱電制冷器正反向工作，改變變溫金屬模塊的溫度，熒光定量PCR檢測使置于金屬模塊里的試管中的反應物達到PCR的要求。參照圖1，熱循環單元包括可插放若干個試管的變溫金屬模塊，熱電制冷器，散熱器，風扇，熱蓋。風扇、散熱器和熱電制冷器依次從兩邊緊貼變溫金屬模塊，由于熱電制冷器采用兩面緊貼的結構，因此熒光定量PCR檢測與普通將熱電制冷器貼在模塊底部的結構比較，單位面積的加熱或制冷功率更大，溫度變化的速度也更高，試管的上方設有防止試管內反應物蒸發的熱蓋。在變溫金屬模塊和熱蓋中分別設有溫度傳感器，傳感器將溫度信號輸給控制單元。
　　該熒光定量PCR檢測的主要優點：
　　1、背景干凈：自主知識產權的不形成二聚體的引物設計使PCR反應背景干凈。
　　2、靈敏度高：由于采用熒光染料(SYBR Green I )，靈敏度高熒光探針PCR一個數量級。
　　3、操作簡便：熒光定量PCR檢測逆轉錄(RT)-實時熒光擴增(PCR)兩步合并單管反應。
　　4、特異性高：由于選取引物序列具有代表性，經過多次的實驗，特異性高。
　　5、價格便宜：由于采用熒光染料，價格比TaqMan探針方法低。
　　熒光定量PCR檢測常見故障維修：
　　故障1機器程序運行中出現“PCR．EXE程序出錯”，點擊后程序關閉，檢測結果丟失。
　　造成這種故障的原因是232接口不良，熒光定量PCR檢測系統在通訊時對232接口的讀寫出現錯誤，就會出現以上報警。將232接口固定緊或重新焊接即可解決。
　　故障2 無試管狀態下各孔的熒光值差異增大。這種現象是因為試管孔或熱蓋被污染，這時需要清除試管孔或熱蓋上的污物。清除污物時用毛刷沾少量*清洗模塊上的錐孔及熱蓋，保證熒光定量PCR檢測試管與錐孔壁接觸充分、導熱良好、避免污染。表面如有污跡，還可用軟布沾清潔膏清洗。注意在儀器進行清洗時，必須切斷電源，清洗模塊上的錐孔時嚴禁將清洗劑滴入孔內。
　　故障3個別熒光曲線突然(較大)下降。造成這種故障的原因主要是試管內留有氣泡，由于溫度升高后可能會造成氣泡破裂，熒光定量PCR檢測使熒光值突變(降低)，因此處理樣本時要注意離心、振蕩均勻，把離心管放置儀器內時要檢查試管內是否有氣泡。
　　故障4模塊降溫速度明顯變慢。造成這種現象的原因有通風孔被阻塞、連接線松動、風機損壞或不運轉、溫度傳感器損壞、制冷片損壞。經檢查發現熒光定量PCR檢測不運轉，導致散熱效果變差，模塊降溫速度變慢。更換故障風機，機器運轉正常。
　　故障5熱蓋無法加熱。造成這種現象的原因有接插件松動、熱蓋中溫度傳感器損壞、熱蓋中加熱元件損壞。首先檢查接頭插件是否松動，然后檢測熱蓋中溫度傳感器和熱蓋中加熱元件，經測量熱蓋中溫度傳感器損壞，更換后儀器使用正常。
　　熒光定量PCR檢測在靶基因被擴增的同時檢測反應物中的熒光信號的強度，而熒光信號的強度與靶基因的濃度是成比例關系的，通過熒光信號的強度能判斷靶基因的濃度。采用光電倍增管檢測熒光強度。即通過光電倍增管將反應物的熒光信號逐一檢測，通過信號的強弱來區分反應物的熒光強度。熒光定量PCR檢測部分中多個濾光片的切換采用了獨立步進電機來實現。長壽命的LED激發光源發出激發光，通過濾光片過濾成特定波長的單色光，再通過透鏡聚焦成平行光照射在二向分色鏡上，二向分色鏡上可以反射波長小于一定值的光，因此激發光被設計成可以被二向分色鏡反射的單色光，激發光被反射通過透鏡聚焦在試管的底部，熒光定量PCR檢測特定波長的激發光束使試管內的反應物發出特定波長的熒光，熒光通過透鏡照射在二向分色鏡上，對于波長大于一定值的光可以穿過二向分色鏡，因此熒光設計成可以穿過二向分色鏡的波長的光穿過二向分色鏡，再被濾光片過濾成特定波長的單色光，zui后被光電倍增管接收變成電信號傳輸給控制單元。濾光片可以分成多個波長，用于過濾不同波長的熒光。步進電機正反向轉動帶動同步帶運動，從而使固定在同步帶上的熒光定量PCR檢測左右移動，使其能逐一檢測各個試管的熒光，同時通過撞擊左右側面的定位板切換濾光片。
　　熒光定量PCR檢測熱循環單元置于箱體內的上部，熒光檢測單元置于其下部，控制單元位于箱體的后部，它執行數據處理單元通過信號線傳輸過來的指令信號來控制熱循環單元和熒光檢測單元按要求工作，同時又將控制熱循環單元和熒光檢測單元中溫度傳感器和光電倍增管的信號處理成數字信號通過信號線傳輸給數據處理單元，熒光定量PCR檢測數據處理單元再將這些信號處理成直觀易懂的曲線或圖表在PC機的顯示屏上顯示出來。