第三章 蛋白定量

                               第三章 蛋白定量

 

       目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Bradford 法（考馬斯亮藍(lán)法）、Lowry 法（Folin-酚試劑法）、 BCA法等。但各有優(yōu)缺點(diǎn)，大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。

       收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大，大家可以根據(jù)具體情況選取。

 Bradford 法（考馬斯亮藍(lán)法）:

      考馬斯亮藍(lán) G-250 有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在 595 nm 處有zui大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。

      該法操作簡便迅速，消耗樣品量少，但不同蛋白質(zhì)之間差異大，且標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差。高濃度的 Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸銨和去污劑對測定有干擾。緩沖液濃度過高時(shí)，改變測定液 pH 值會影響顯色。

Lowry 法（Folin-酚試劑法）:

      林-酚試劑（Folin-phenol reagent）的顯色原理是：首先在堿性條件下蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物，該復(fù)合物隨之將磷鉬酸-磷鎢酸還原成藍(lán)色復(fù)合物。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)量成正比，蛋白質(zhì)濃度范圍約在 25～250 μg/mL。

     雖然該法是測定蛋白質(zhì)濃度應(yīng)用zui廣泛的方法之一，但其缺點(diǎn)也很明顯，專一性較差，干擾物質(zhì)多（如Tris 緩沖劑、蔗糖、硫酸銨、巰基化物、酚類、檸檬酸等），標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線關(guān)系不特別嚴(yán)格。因此在其應(yīng)用過程中有很多新的修正。

BCA 法（二喹啉甲酸法）:

      二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA )法是Lowry測定法的一種改進(jìn)方法，是近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性條件下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在 562 nm處有高的光吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度。

與 Lowery 法相比，BCA 蛋白測定方法操作更簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性更好，幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度高（微量檢測可達(dá)到 0.5 μg/ml），應(yīng)用更加靈活。與 Bradford 法相比，BCA 法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。

      BCA 法與 Lowry 法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度zui高，且與一系列干擾 Lowry，BCA 反應(yīng)的還原劑（如 DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的，其zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。